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LAMP即环介导等温扩增，它利用4条模板专一的特异引物、和具有链置换能力的Bst2.0 DNA聚合酶，在65℃左右条件下，30～60分钟完成逆转录和LAMP扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于定性PCR技术，同时还不需要昂贵的仪器设备。目前已成功应用于生物的快速检测，广泛用于各个领域。

• 操作简单，只用一步（约5～10分钟）即可以得到用于LAMP扩增的模板。
  
• 即开即用，含有红色电泳示踪剂，扩增后可以直接上样，不需要上样液。
  
• 高特异性，精心优化的配方，非特异扩增比自配的试剂更低。
  
• 65℃左右等温扩增，不需要贵重仪器。
  
• 环保健康，不使用任何有毒有害的试剂。

• 如果有N个样品，最好设置N+2个样品制备，多出的两个：一个是样品制备阳性对照，一个是样品制备阴性对照。

1. 在1.5mL或0.5mL的塑料管中加入50μL广谱DNA释放剂。
   
2. 再加入2μL液体样品（如全血、细胞培养液等）或2mg（约半粒芝麻大小）的固体样品（如动物组织、植物叶片等）。
   • 固体样品用量最好不要超过1mg/10μL的比例，液体样品用量最好不要超过1μL/10μL的比例。
3. 对于液体样品，室温放置3分钟；对于固定样品80℃加热5分钟；对难以破裂的样品（如有厚壁的真菌、石蜡切片、血斑），则保温时间可以延长到10分钟。得到的溶液称为样本裂解产物。
   
4. 简短振荡混匀后取样品裂解产物立即取0.5μL直接进行20μL体系的LAMP扩增或其他扩增。
   
   • 加入裂解产物体积不要超过LAMP反应体积的1/40。

5. 配制5×LAMP引物混合液先加超纯水将合成的HPLC级别的下列引物干粉稀释到下表所标注的母液浓度，然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物母液和超纯水，最后得到1mL的5×LAMP引物混合液，此混合液足够250次20μL体系的LAMP扩增。如果需要配制的5×LAMP引物混合液体积异于1mL，则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置2年。
   

   引物名称	母液浓度	加母液量	在5×LAMP引物混合液中的浓度
   FIP引物	100μM	80μL	8μM
   BIP引物	100μM	80μL	8μM
   F3引物	100μM	10μL	1μM
   B3引物	100μM	10μL	1μM
   Loop F	100μM	20μL	2μM
   Loop B	100μM	20μL	2μM
   超纯水		780μL
   终体积		1mL

   • 如果没有Loop引物，则用超纯水补足其体积。
6. 在冰上融化4×LAMP MasterMix，混匀，稍离心。第一次使用时，请将50μL Bst2.0 DNA聚合酶(8U/μL)全部加入到4×LAMP MasterMix中并轻柔混匀至少1分钟，然后再使用。如果有N个样品，则在N+2个反应管中加入以下成分，多出的一管是LAMP扩增阳性对照（PC），一管是LAMP扩增阴性对照（NC）：
   

   成分	N+2个样品管	LAMP扩增PC	LAMP扩增NC
   4×LAMP MasterMix(含Bst2.0)	5μL	5μL	5μL
   自备的5×LAMP引物混合液	4μL	不加	4μL
   阳性对照模板-引物混合物	不加	4μL	不加
   释放的DNA模板	0.5μL	不加	不加
   超纯水	至20μL	至20μL	至20μL

7. 混匀，置于65℃保温60分钟。如果是在PCR仪中保温，必须加热盖。如果用金属浴或水浴保温，没有热盖，必须覆盖50μL的自备石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，会严重影响反应效率。
   
8. 扩增结束后取5～10μL扩增产物直接上样进行2～3%的琼脂糖凝胶电泳，有LAMP扩增的样品将出现LAMP特征性DNA梯度电泳图谱。
   • 本制品含有红色电泳示踪剂，不需要再加上样液，红色示踪剂的泳动速度相当于50bp的DNA。
   
   
9. 结果分析：如果本试剂盒提供的阳性对照-引物混合物能够扩增而阴性对照不能扩出，则实验有效。如果阳性对照-引物混合物没有扩增出条带，则试剂盒的问题，请跟厂家联系。如果阴性对照（水作为模板）有扩增出条带，则说明LAMP样品或试剂有过去的扩增产物的污染，需要注意操作的规范性，如果不能解决，可以重新设计LAMP引物扩增新的靶片段。